HLA分型技術

HLA的研究也涉及免疫學、生物學、遺傳學、分子生物學、醫學等多個學科甚至成為獨立學科分支,由於研究範圍龐大組織相容性與免疫研討會(International HLA & Immunogenetics Workshop;IHIW)在國際免疫遺傳學計畫(ImMunoGeneTics project)中也設立了IPD-IMGT/HLA資料庫,各地區也有各自的組織相容性學會並每年召開交流會議,如:美國的組織相容性及免疫遺傳學會(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics;ASHI)、歐洲的組織相容會議(European Federation for Immunogenetics;EFI)。

HLA分型方法(HLA Typing Method)

HLA血清學分型(Serology)

在60年代開發的補體依賴性細胞毒性測試(Complement-Dependent Cytotoxicity; CDC)可用於HLA分型。由於其簡單性和低成本,血清學是許多只需要低分辨率HLA-A和HLA-B分型實驗室的首選方法(僅鑑別相關等位基因組)。相比之下,分子分型幾乎完全取代了CDC的血清學不夠精確的其他HLA-基因座(HLA-C,DR和DQ)。

以分子技術(molecular techniques)進行分型

序列特異性寡核酸法 (Sequence-Specific Oligonucleotides Probes;SSO 或ASO)

以同位素或非放射性標記的探針與PCR擴增的目標片斷產物直接雜交(direct hybridization),或是將探針固定在固體支持物上,例如用顏色編碼的微球體,並與標記的PCR產物反向雜交(reverse hybridization)根據訊號點位判斷個體基因型。

優點: 靈敏度高、特異性強、需樣本量少

缺點: 解析度不及SSP和SBT、大量和高純度樣本、易出現誤差、不能檢測新等位基因

序列特異性聚合酶連鎖反應 (Sequence-Specific Primers;SSP)

PCR技術獲得HLA的特異性擴增產物,通過電泳直接分析確定HLA分型。

優點: 簡單易行、解析度可從低到高、成本低

缺點: 不易自動化、試劑盒需不斷升級、不能檢測新等位基因、需大量試劑、不能識別偽基因(Pseudogene)

核酸定序技術 或 直接定序法 (Sequencing-Based Typing;SBT)

天才大師桑格 (Sanger)發明的核酸定序技術,以PCR擴增 HLA 特異性產物後進行DNA定序結果分析其等位基因型。

使用在桑格定序法 (Sanger SBT;SSBT)和次世代定序技術(NGS)上,因此定序法上通常指桑格定序法。

優點: 解析度高、可大規模進行、精確度高、能直接發現新的等位基因

缺點:  由於DNA有異基因型(Heterozygous)的存在,較易出現歧義性(Ambiguity)

次世代定序技術 (Next Generation Sequencing;NGS)

次世代定序法(NGS)是將DNA片段變成大量短片段再拼回去,藉由大量而快速短序列片段(Short Reads)的定序方式,在短時間內能有效增加比對數減少錯誤率。

優點: 解析度高、誤差小、精確度高、能進行自動化、能發現新的等位基因、可分辨純合基因型(Homozygous)

          和異基因型(Heterozygous)

缺點:  各家技術略有差異、數據量大、數據分析設備要求、軟體可能影響分型結果

第三代定序技術 (Third Generation Sequencing)

優點: 快速、長片段定序(通常大於10000 bp),不依賴參考基因組 (Reference Genome) 避免重複序列(Repeated Sequence)及缺失片段的問題。

缺點:  通量低、成本高、誤差率待改善。第三代主流技術方向未確定,使用在HLA分型上效益也待確認。

太平洋生物公司(Pacific Biosciences)的單分子即時定序法 (Single Molecule Real-Time Sequencing;SMRT):

利用零模波導孔(Zero-Mode waveguide;ZMW)所創造出僅容納數個分子的孔徑,將DNA聚合酶 (Polymerase)放置ZMW中,偵測 DNA 聚合時產生的螢光並透過環狀 DNA 重複定序。

牛津奈米孔技術(Oxford Nanopore Technology) 的奈米孔定序法 (Nanopore Sequencing):

透過膜的兩端有電位差,當單股 DNA 上的不同鹼基通過跨膜蛋白時,會產生不同大小的電流,進而達到即時定序的目的。